Strukturelle Einblicke in die selektive Aktivierung von PKG1α durch kleine Moleküle

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 798 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die cGMP-abhängige Proteinkinase I-α (PKG1α) ist aufgrund ihrer Rolle bei der Regulierung der Funktion der glatten Muskulatur ein Ziel für pulmonale arterielle Hypertonie. Während sich die meisten Arbeiten auf die Regulierung des cGMP-Umsatzes konzentrierten, haben wir kürzlich mehrere niedermolekulare Werkzeugverbindungen beschrieben, die in der Lage waren, PKG1α über einen cGMP-unabhängigen Weg zu aktivieren. Ausgewählte Moleküle wurden in Gegenwart von PKG1α kristallisiert und es wurde festgestellt, dass sie an eine allosterische Stelle in der Nähe der Nukleotidbindungsdomäne mit niedriger Affinität binden. Diese Moleküle verdrängen die Schalterhelix und bewirken die Aktivierung von PKG1α, was einen neuen Mechanismus für die Aktivierung und Kontrolle dieses entscheidenden Therapiepfads darstellt. Die beschriebenen Strukturen sind für das Verständnis der Funktion und Kontrolle dieses wichtigen Regulationswegs von entscheidender Bedeutung.

Die von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) abhängige Signalübertragung ist an der Regulierung zahlreicher Signalwege beteiligt1. Seine Rolle für die Herz-Kreislauf-Gesundheit kann nicht unterschätzt werden. Von der Förderung der Entspannung der glatten Muskulatur als Reaktion auf Stickstoffmonoxid2,3 über die Verhinderung der Blutplättchenaggregation4 bis hin zur Abschwächung des Thrombinrezeptor-Protease-aktivierten Rezeptors-1 (PAR-1) über den Regulator des G-Protein-Signalwegs-2 (RGS2). 5: Die cGMP-Signalübertragung trägt zur Aufrechterhaltung und Regulierung der normalen Gefäßfunktion und des Blutdrucks bei. Erfolgreiche Strategien zur Regulierung der pulmonalen Hypertonie konzentrierten sich auf die Stimulierung der löslichen oder partikulären Guanylatcyclase (sGC) mit dem ersten derartigen Therapeutikum, Riociguat, das in den Vereinigten Staaten zur Verwendung zugelassen wurde6,7. Ähnliche Effekte können durch Hemmung des cGMP-Abbaus durch Phosphodiesterasen (PDEs)8,9,10,11 erzielt werden. Allerdings ist die gezielte Hemmung von sGC oder PDE letztendlich unspezifisch, da sie dazu dient, den cGMP-Spiegel zu erhöhen, der in zahlreichen nachgeschalteten Signalwegen eine Rolle spielt, einschließlich der Signalübertragung durch cGMP-abhängige Proteinkinase (PKG)1,12. Durch die direkte Aktivierung von PKG1α könnte ein direkter Einfluss auf kardioprotektive Mechanismen ohne die Komplikation der unspezifischen systemischen Wirkung der cGMP-Signalisierung erzielt werden13.

PKG1 kommt in zwei primären Isoformen vor, PKG1α und PKG1β, die das Produkt alternativen Spleißens sind14. Die kardiovaskuläre Expression beider Isoformen ist weit verbreitet und mit den nachgeschalteten Aktivierungseffekten verbunden, die durch die sGC-abgeleitete cGMP-Produktion hervorgerufen werden15. Während die Domänenorganisation zwischen beiden Isoformen erhalten bleibt (Abb. 1a), ist die Heterogenität auf die Dimerisierungsdomäne beschränkt, die sowohl den Leucin-Zipper als auch die autohemmenden Domänen enthält (Abb. 1b). Die Gesamtsequenzidentität ist hoch (~90 %), wobei die Unterschiede in der Sequenz auf die ersten 89 und 104 Reste für PKG1α und PKG1β beschränkt sind (~28 % paarweise Identität), mit 100 % Identität in den übrigen Sequenzen. Die PKG1α-Isoform reagiert empfindlicher auf cGMP-Konzentrationen als die 1β-Isoform, was darauf hindeutet, dass der Unterschied in der Empfindlichkeit wahrscheinlich direkt auf die Dimerisierungsdomäne zurückzuführen ist, die auch eine autoinhibitorische (AI) Subdomäne enthält14,16,17. Innerhalb der AI liegt die Pseudosubstratsequenz, in der die erforderliche S/T-Phosphorylierungsstelle durch G/A für α/β ersetzt wurde18,19. Diese nahezu einheitliche Identität unterstreicht die Ungleichheit zwischen den für PKG1α und 1β (PDB: 3SHR bzw. 4Z07) gemeldeten Strukturen weiter20,21.

Ein von PKG1α konstruiertes Monomer, das Domänen und Subdomänen hervorhebt, wie sie der schematischen Darstellung (b) der Domänen entsprechen, wobei α oben und β darunter sichtbar ist. Die Grenzen der Domänenreste für jede Isoform sind angegeben. Die regulatorische Domäne besteht aus einer Dimerisierungs-Subdomäne und einer cGMP-Bindungs-Subdomäne. Die Dimerisierungssubdomäne besteht aus einem Leucin-Zipper (LZ) und einer autoinhibitorischen Region (AI), die eine Rolle bei der Proteinregulation über das Pseudosubstrat (PS) spielt. Während die cGMP-bindende Subdomäne aus zyklischen Nukleotidbindungsstellen mit hoher (CNB-A) und niedriger Affinität (CNB-B) besteht, die cGMP direkt binden. Die fortschreitende Bindung von cGMP an diese Stellen führt letztendlich zur Freisetzung der AI-Domäne und zur Erweiterung der katalytischen Domäne weg von der regulatorischen Domäne, was eine ATP-vermittelte Substratkatalyse ermöglicht. c Die ausgerichteten Sequenzen der α- und β-Dimerisierungsdomänen sind sichtbar. Alle Reihenfolgeunterschiede zwischen den beiden Varianten beschränken sich auf diese Subdomäne. Einem Sequenzähnlichkeitshistogramm wird eine hohe Ähnlichkeit überlagert, die als Balken oberhalb der Linie und eine niedrige oder keine Ähnlichkeit als Balken unterhalb der Linie angezeigt wird.

cGMP-Mimetika waren der vorherrschende Mechanismus, der zur Gewinnung niedermolekularer PKG1-Aktivatoren genutzt wurde, und sind anfällig für Aktivitäten außerhalb des Ziels5. Es wurden auch synthetische Peptide entwickelt, die nachweislich die Verengung endothelfreier Arterien verringern17. Es wird angenommen, dass diese Peptidderivate die Schalterhelix nachahmen und dadurch verdrängen und die Regulierung der PKG1α-Aktivität verhindern17,22.

Wir haben kürzlich über eine Reihe von Piperidin-basierten niedermolekularen PKG1α-Aktivatoren (SMA)23,24,25 berichtet. Es wurde gezeigt, dass diese Moleküle die Aktivität von PKG1α in konzentrationsabhängiger Weise steigern. In zellbasierten Tests wurde gezeigt, dass sie die Phosphorylierung des bekannten PKG1-Substrats, des vasodilatatorisch stimulierten Phosphoproteins (VASP), erleichtern und antiproliferative Wirkungen in menschlichen glatten Lungenarterienmuskelzellen (hPASMC) zeigen25. Biochemische und biophysikalische Studien sowie erste Modellierungsbemühungen deuten auf eine allosterische Bindungsstelle in der Nähe der cGMP-Bindungsdomäne mit niedriger Affinität (CNB-B)23 hin. Im PKG1α voller Länge erhöhen diese Verbindungen allosterisch die Bindungsaffinität von cGMP für die CNB-A-Stelle (positive Bindungskooperativität) und verringern die scheinbare Affinität von cGMP für die CNB-B-Stelle (allosterische Konkurrenz). Die allosterische Bindungsstelle der Piperidinreihe wurde später durch Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) bestätigt und schließlich durch nachfolgende hochauflösende Röntgen-Cokristalle der CNB-B-Domäne mit verschiedenen gebundenen SMAs bestätigt25. Bei dem Versuch, den Wirkungsmechanismus von SMA zu verstehen, haben wir versucht, größere Fragmente von PKG1α zu kristallisieren als zuvor beschrieben. Hierin werden hochauflösende Cokristallstrukturen für das verkürzte CNB-B beschrieben, das über die Schalterhelix an die Kinase/katalytische Domäne (CAT) gekoppelt ist. Diese Strukturen wurden mit verschiedenen SMA sowie cGMP mit ATP mit einer Auflösung von 2,00 Å erhalten. Rekonstruktionen von PKG1α auf Basis dieser Kristalle sowohl im aktivierten als auch im Ruhezustand wurden ebenfalls abgeschlossen. Dieses Modell bietet detaillierte Einblicke in die Interaktionskaskade, die letztendlich zur PKG1α-vermittelten Phosphorylierung von Proteinsubstraten führt.

Eine neuartige Piperidin-Reihe von SMAs wurde zuvor durch ein Ultrahochdurchsatz-Screening (uHTS) einer internen Sammlung von Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA, bestehend aus etwa 2,9 Millionen Verbindungen, identifiziert24. Die uHTS-Treffer und Analoga aus Optimierungsbemühungen zeigten eine konzentrationsabhängige Steigerung der Aktivität von teilweise aktiviertem PKG1α (teilweise Aktivierung bei EC20 in Gegenwart von 10 nM cGMP, Vo ~ 0,13 μmol min−1 mg−1; als Referenz EC50 ~ 30). nM cGMP entspricht V0 ~ 0,25 μmol min−1 mg−1; siehe ergänzende Abbildung 1 für das vollständige cGMP-induzierte PKG1α-Aktivierungsprofil)23,24,25. Verbindungen aus Optimierungsbemühungen zeigten die Fähigkeit, PKG1α unabhängig von cGMP zu aktivieren, wie beispielsweise SMA1, SMA2 und SMA4 (Abb. 2)25. Die Steigerung der SMA-Aktivierungsstärke (EC50) in Gegenwart von cGMP (Abb. 2) steht im Einklang mit der beobachteten Zunahme der Bindungsaffinität von SMAs in Gegenwart einer zunehmenden cGMP-Konzentration (ergänzende Abb. 2). Diese beobachtete gegenseitige Modulation der Bindungsaffinitäten wird auf die positive Bindungskooperativität zurückgeführt, die zwischen den Aktivatoren der Piperidinserie und dem an CNB-A23 gebundenen cGMP beobachtet wird. Die beobachtete allosterische Natur der SMA-Bindungsstelle in PKG1α voller Länge wird in der ergänzenden Abbildung 3 für SMA3 und SMA4 nach einer zuvor beschriebenen Fluoreszenzpolarisationsmethode zusammengefasst, die die Modulation der cGMP-Affinität für CNB-A und CNB-B bei zunehmender Konzentration von verfolgt SMA23. Die nichtlineare Steigerung der scheinbaren cGMP-Affinität (Kd, app) für CNB-A zeigt die allosterische Bindungskooperativität zwischen SMA und an CNB-A gebundenem cGMP (ergänzende Abbildung 3A). Andererseits rekapituliert die nichtlineare Abnahme der scheinbaren Bindungsaffinität von cGMP für CNB-B mit zunehmender SMA-Konzentration die zuvor berichtete negative Bindungskooperativität (allosterische Konkurrenz) zwischen SMA und an CNB-B gebundenem cGMP (ergänzende Abbildung 3B). ). Es wurde gezeigt, dass diese negative Bindungskooperativität im isolierten Fragment der regulatorischen Domäne (PKG1α78–355) erhalten bleibt, was die Lokalisierung der SMA-Bindungsstelle in der Nähe von CNB-B23 unterstützt. Um die Bindungseigenschaften der Aktivatoren besser zu verstehen, wurde ein Docking-Modell basierend auf einer zuvor veröffentlichten PKG1α-Struktur (PDB: 3SHR)21 erstellt. Die anfängliche Kristallisation mit der CNB-B-Domäne und SMA1 bestätigte die Bindung an einer allosterischen Stelle (Nest) in der Nähe der cGMP-Bindungsstelle25. Mehrere SMA wurden auf ihre Fähigkeit zur Cokristallisation mit verschiedenen Konstrukten von PKG1α getestet. Während SMA1 bei der Untersuchung von CNB-B nützlich war, konnten wir für die beschriebenen Strukturbemühungen Cokristalle der CNB-B/Switch-Helix/CAT-Konstrukte mit SMA2, SMA3 und SMA5 erhalten (Abb. 2).

a Steigerung der Aktivität von teilweise aktiviertem PKG1α (EC20 mit 10 nM cGMP) und b Steigerung von PKG1α aus dem Grundzustand (kein cGMP) bei steigenden Konzentrationen von SMA1, SMA2, SMA3, SMA4 und SMA5, verfolgt mit dem ADP-Glo-Kinase-Assay. c Tabelle zeigt Schätzungen der Aktivierungsstärke (EC50) aus nichtlinearen Anpassungen der Konzentrations-Reaktionskurven aus (a, b). Die EC50-Werte waren der Durchschnitt von 3 bis 6 unabhängigen Versuchen (Fehler dargestellt als ±SE).

Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass die SMA-Serie innerhalb einer beschriebenen Nest-Region bindet, die normalerweise von der Schalterhelix besetzt ist. Wie bei den zuvor beschriebenen S-Gezeiten17 vermuteten wir, dass die SMA die Helix verdrängt und die Struktur in einen offenen und aktivierten Zustand zwingt. Zur Überprüfung wurden mehrere Konstrukte von CNB-B in Gegenwart von SMA1 (PDB: 7SSB, Abb. 3a) mit einer Auflösung von 1,4 Å kristallisiert. Diese Struktur wies einen RMSD des Rückgrats von 0,858 Å und einen RMSD aller Atome von 1,449 Å bis 3 SHR auf (Abb. 3).

Überlagerung von 7SSR (rot) und 3SHR (blau) mit SMA1 (a) oder der Trans-Chain-Switch-Helix (b), gebunden in der Nestregion von CNB-B. SMA1 ist als Referenz in Cyan-Stäbchen dargestellt. Die Ligandenreste der Schalterhelix bestehen aus F351, F352, N354 und L355 und sind unterstrichen, um sie von Site-Resten zu unterscheiden. Das Nest wird mit einer Mesh-Oberfläche auf Basis von 7SSR gerendert. Restbindungswechselwirkungen zwischen der Stelle und der Bindungseinheit werden beschriftet und mit gestrichelten Linien angezeigt. Die Wechselwirkungen mit W289 und F258 bleiben erhalten, während SMA1 zusätzliche Wechselwirkungen tiefer in der Tasche eingeht, einschließlich mit F222 und F321. Dies erfolgt zusätzlich zu einer Interaktion mit Q296. Beachten Sie, dass die Dichlorphenyl-Einheit dort positioniert ist, wo F351 normalerweise gebunden hätte, jedoch aufgrund ihres Winkels und ihrer Tiefe erhöhte Bindungswechselwirkungen aufweist. Dieses erhöhte Maß an Bindungsinteraktion steht im Einklang mit seiner Fähigkeit, die Schalterhelix in teilweise aktiviertem PKG1α zu verschieben.

Obwohl erste Kristallisationsbemühungen das zuvor veröffentlichte Kristalldimer (PDB: 3SHR)21 reproduzierten, blieben Fragen offen, wie sich die fehlenden Domänen (der Leucin-Zipper (LZ) und CAT) in Bezug auf die kristallographische Konformation positionieren würden. Diese Inkonsistenz schien im Zusammenhang mit neueren Strukturen für die eng verwandte PKG1β-Isoform (PDB: 4Z07)20 sowie für die kristallisierte katalytische Domäne (PDB: 6BDL)26 relevanter zu sein. Wir stellten die Hypothese auf, dass die erweiterte Konformation auf das Fehlen der katalytischen Domäne zurückzuführen sein könnte und dass PKG1α in seiner Anwesenheit leichter ein kompakteres Homodimer annehmen würde, wobei die Schalterhelices eine selbstregulierende Rolle spielen, anstatt wie zuvor das dimere Gegenstück zu beeinflussen Dies wird durch die ∆CAT-PKG1α-Strukturen nahegelegt, die wahrscheinlich eine antiparallele dimere Anordnung annehmen21,22. Diese Autoregulationsfunktion scheint mit Beobachtungen übereinzustimmen, dass ∆LZ-PKGI-Monomere in Lösung nahezu identische Aktivierungsprofile wie ihre dimeren Gegenstücke aufweisen, was darauf hindeutet, dass die Regulierungsfunktion der Schalterhelix intakt bleibt, obwohl sie im Monomerzustand vorliegt20,27,28 . Darüber hinaus legten frühere Studien mit Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) nahe, dass PKG1α in seinem vollständig aktivierten Zustand eine stark asymmetrische Struktur mit einer maximalen linearen Abmessung von etwa 165 Å im Grundzustand bildet . Diese erhöhte Länge ist durch eine Bewegung vom Kern zur Peripherie hin gekennzeichnet.

Um die Struktur und den Einfluss der nicht kristallisierten Domänen besser zu verstehen, wurden die CNB-B-Domäne, die Schalterhelix und die vollständige katalytische/Kinase-Domäne in Gegenwart von ATP und cGMP (PDB: 7T4T) mit einer Auflösung von 2,0 Å kristallisiert (Abb. 4). ). Beim Ausrichten und Überlagern der katalytischen Domäne mit gebundenem AMP-PNP (PDB: 6BG2) wurde festgestellt, dass der Gesamtatom-RMSD unter 1 Å liegt (Abb. 5). Während wir hauptsächlich an der Auswirkung der cGMP-Bindung interessiert waren, wurde festgestellt, dass ATP das Konstrukt stabilisiert, die Kristallisation erleichtert und die endgültige Auflösung verbessert. Die kombinierten Domänen wurden auch in Gegenwart von drei SMAs (PDB: 7T4U, 7T4V, 7T4W für SMA2, SMA3 bzw. SMA5) kristallisiert. Versuche, das Konstrukt in einer Basal- oder Apo-Form zu kristallisieren, waren erfolglos. Wie zu beobachten ist (Abb. 4c), hat SMA2 einen deutlichen Einfluss auf die Proteinkonformation und zwingt die regulatorische Helix dazu, sich zu öffnen und um bis zu 30 Grad nach außen zu drehen. Die katalytische Domäne verhält sich wie ein starrer Körper (Abb. 5), ohne dass sich die lokale Konformation ändert. Wenn der Regelkreis ausgeschlossen ist, weist die Domäne einen Allatom-RMSD von nur 0,94 und 1,18 Å gegenüber zuvor veröffentlichten apo- und AMP-PNP-gebundenen Strukturen (PDB: 6BDL bzw. 6BG2)26 auf. Der Hauptunterschied zwischen den Strukturen liegt in der regulatorischen Helix, die sich in Gegenwart der SMA um etwa 20° von CNB-B weg dreht (Abb. 4d). Dies führt dazu, dass sich die katalytische Domäne um etwa 30 Å gegenüber dem cGMP- und ATP-gebundenen Zustand verschiebt. Identische Verschiebungen wurden bei allen 3 SMA beobachtet (PDB: 7T4U, 7T4V, 7T4W). Statistiken für die kristallographischen Daten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

eine Überlagerung von 3SHR (blau) mit 7T4T (gelb) und 7SSR (rot) auf der CNB-B-Domäne. Beachten Sie die dramatische Verschiebung der Position der Schalterhelix (SW) in Gegenwart der katalytischen Domäne (CAT). b Struktur der C-terminalen Domänen von PKG1α 7T4T (CNB-B/SW/CAT + ATP + cGMP), c 7T4U + SMA2. CNB-B ist blau, SW ist cyan und CAT ist rot. d Überlagerung von (b) und (c) mit 7T4U in Gelb und 7T4T in Blau. Beachten Sie, dass sich die nach SW führenden Rückstände um etwa 60° nach außen drehen, bevor sie zurückdrehen. Der SW mit gebundenem SMA2 dreht sich um etwa 20° von CNB-B weg gegenüber der Ausrichtung im cGMP-gebundenen Zustand. Die RMSD-Matrizen sowohl der CNB-B- als auch der CAT-Domäne zeigen, dass jede als starrer Körper fungiert, wobei Änderungen in der Ausrichtung oder Präsentation auf die SW verwiesen werden.

Eine katalytische Domäne von PDB: 7T4V in blauen Bändern ist mit der Apo-Struktur in Grau (PDB: 6BDL) und der ATP-gebundenen Struktur in Schwarz (PDB: 6BG2) überlagert, beide als Röhren. Die Kinaseregionen wurden mit Anmerkungen versehen, um Orientierung und Kontext zu bieten. Der beobachtete Allatom-RMSD für die Domäne ist extrem niedrig, wobei ein Großteil der Abweichung in der regulatorischen Schalterhelix auftritt, die eine Änderung ihres Austrittswinkels von etwa 10° aufweist. AMP-PNP von 6BG2 wird in der ATP-Tasche sichtbar gemacht. SMA3 wird im Nestbereich von CNB-B angezeigt. Die katalytische Domäne selbst verhält sich größtenteils wie ein starrer Körper, wie anhand der Spuren und der paarweisen RMSD-Matrix (c) der Reste 360–671 beobachtet werden kann. Bei der Untersuchung der SMA3-Position innerhalb der Nestdomäne (b) von CNB-B tragen die SW-Helixreste (unterstrichen) zur zuvor beobachteten Bindungsstelle bei, indem sie eine zusätzliche Oberfläche für Interaktionen hinzufügen. A339 aus der Helix arbeitet mit L225 und T221 zusammen, um eine hydrophobe Tasche zu vervollständigen, die den Phenylsubstituenten besetzt, während die Methylbenzoesäureeinheit mit A343 und K344 interagiert. Die Netzoberfläche ist von lipophil (grün) bis hydrophil (lila) gefärbt.

In der ATP- und cGMP-gebundenen Form des aktuellen CNB-B/SW/CAT-Konstrukts wachsen Kristalle in einer anderen Raumgruppe (P21 a = 73,1 Å b = 96,7 Å c = 81,1 Å β = 93,6°), die sich von unterscheidet das (konsistent) aus demselben Konstrukt mit einem unserer SMA-Liganden erhalten wurde (P212121 a = 93,2 Å b = 103,2 Å c = 104,1 Å). Pro asymmetrischer Einheit wurden zwei Kopien des Moleküls beobachtet, aber wie bei früheren Strukturen mit demselben Konstrukt stimmte die Kristallpackung mit einem Monomer-Oligomerisierungszustand in Lösung überein. Dies wurde durch visuelle Inspektion und PISA-Analyse bestätigt. Kette B zeigte etwas mehr Ordnung als Kette A, aber in allen Fällen gab es eine wohldefinierte Elektronendichte für ATP und cGMP.

Bei der Untersuchung der Schalterhelix war die N-terminale Hälfte der Helix gegen CNB-B gepackt und trug zur cGMP-Bindungsoberfläche bei. Dies scheint zwar mit der Besetzung der allosterischen Aktivatorbindungsstelle durch die Schalterhelix übereinzustimmen, eine Apostruktur zur Bestätigung des Packungsmodus der Helix gegenüber der Nestbindungsstelle konnte jedoch nicht kristallisiert werden. Bezüglich des C-terminalen Endes der Helix können Kontakte zwischen einem kleinen Bereich des N-terminalen Lappens der katalytischen/Kinase-Domäne und den letzten beiden Windungen der Schalterhelix beobachtet werden (Abb. 4).

Versuche, den Aktivator mit Kristallen zu tränken, die die veröffentlichte Struktur der regulatorischen Domäne (PDB: 3SHR) reproduzieren, führten nicht zur Bildung von Cokristallen. Dies scheint damit im Einklang zu stehen, dass die Schalterhelix zu einem geschlossenen Zustand des Nests beiträgt. Oder anders ausgedrückt: Die konkurrierende Bindung zwischen SMA und SW um das Nest führte zu stabileren Kristallen mit gebundener Helix. Es wurde jedoch ein Cokristall mit SMA1 (PDB: 7SSB, Abb. 3a) und ein Konstrukt erhalten, das nur CNB-B umfasste . Die Bindung von SMA1 scheint mit der zuvor von der Schalterhelix in 3SHR besetzten Tasche übereinzustimmen (Abb. 3b). Im aktuellen CNB-B/SW/CAT-Konstrukt ermöglichte die für SMA3 beobachtete Elektronendichte eine eindeutige Bestimmung der Bindungsposition. Insbesondere wurde die Chiralität der drei Chiralitätszentren klar definiert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass SMA2 (Abb. 4), SMA3 und SMA5 eindeutig an das auf CNB-B gefundene Nest binden (PDB: 7T4U, 7T4V, 7T4W).

Wie bereits erwähnt, unterscheidet sich die Schalterhelix des aktuellen Kristalls deutlich von der zuvor beschriebenen (PDB: 3SHR). Bemerkenswert ist, dass sich das C-terminale Ende der Schalterhelix nach hinten faltet und gegen CNB-B drückt, anstatt von seinem Monomer weg zu zeigen (Abb. 4a). Zwar gibt es viele Möglichkeiten, die diese Diskrepanz erklären könnten, die einfachste ist jedoch das Vorhandensein der Kinasedomäne, die die notwendigen Kontakte und die Struktur bereitstellt, um die Schalterhelix in einem gepackten Zustand zu halten und sie zwischen CNB-B und CAT zu fixieren. In Abwesenheit der katalytischen Domäne wird Stabilität dadurch erreicht, dass die Schalterhelix gegen das benachbarte Monomernest von CNB-B gepackt wird, was die zuvor beobachtete erweiterte Struktur (PDB: 3SHR) ergibt (Abb. 3b).

Es ist klar, dass die CAT-Domänen nicht zu den Bindungsdomänen von CNB-B beitragen, weder an der Bindungsstelle für zyklische Nukleotide mit niedriger Affinität noch am Nest. CAT scheint gut isoliert zu sein und wird nur dann aktiv, wenn sich PKG1α in einem aktiven Zustand befindet, der durch cGMP-Bindung oder die Anwesenheit eines Aktivators hervorgerufen wird. Die Kinasedomäne liegt an der C-terminalen Region der Schalterhelix und vor allem wird die Kinase an Thr517 mit Glu409 an der richtigen Position für die Katalyse phosphoryliert.

Im Gegensatz dazu trägt die Schalterhelix tatsächlich zur CNB-B-SMA-Bindungsstelle bei, wie aus 7T4V hervorgeht (Abb. 5). Es wird beobachtet, dass die Schalterhelix SMA3 kreuzt. In der Nahaufnahme (Abb. 5b) ist der Phenylsubstituent an der Piperidinyl-2-Position in einer hydrophoben Tasche eingeschlossen, die aus L225 und T221 besteht und durch Ala339 des SW vervollständigt wird. Die Methylbenzoesäure-Einheit auf 1-Stickstoff-Packungen entlang der Peptidbindung zwischen Ala343 und Lys344; Wechselwirkungen sind meist hydrophob oder beinhalten π-π-Stapelung.

Es wurde zuvor gezeigt, dass die SMA bevorzugt PKG1α gegenüber der PKG1β-Isoform25 aktiviert. In vivo würde diese Selektivität durch die höhere Affinität der α-Isoform für cGMP gegenüber der β-Spleißvariante19,31 noch verstärkt. Es wurde zuvor gezeigt, dass die KD von cGMP für PKG1α im Vergleich zu PKG1β32,33 um das 6–10-fache ansteigt. SMA3 erforderte eine 6,5-fache, während SMA1 und SMA2 eine 12-fache Konzentrationserhöhung erforderten, um in Gegenwart von 100 nM cGMP den gleichen Aktivierungsgrad auf PKG1β hervorzurufen, im Vergleich zu den 10 nM, die für PKG1α25 verwendet wurden. Es ist wichtig zu beachten, dass die gemeldeten Aktivitäten sowohl für PKG1α als auch für PKG1β mit Protein voller Länge bestimmt wurden. Diese bevorzugte Aktivierung von α wurde auch von Moon et al. beobachtet. und ihre synthetischen Peptide17. Da die Unterschiede zwischen den beiden Isoformen auf die Dimerisierungsdomäne beschränkt sind (Abb. 1), muss diese Domäne eine direkte Rolle bei der Regulierung des Systems als Ganzes spielen. Ein Multifaktor-Regulationssystem, an dem der Leucin-Zipper, die autoinhibitorische Domäne und das Pseudosubstrat beteiligt sind, scheint alle zu dieser unterschiedlichen cGMP-Empfindlichkeit beizutragen und könnte möglicherweise einen ähnlichen Effekt auf die Bindungsprofile des SMA haben33,34. Abgesehen von der Dimerisierung der Monomere scheint die LZ keine direkte Rolle bei der Regulierung von PKG1 zu spielen. Wir nehmen an, dass die LZ dazu dient, das System zu dimerisieren und die AI-Sequenzen in der Nähe der CAT-Domänen jedes Monomers zu halten. Es ist wahrscheinlich, dass die erhöhte Empfindlichkeit von α gegenüber β darauf zurückzuführen ist, dass die Dimerisierungsdomäne um 14 Reste kürzer ist (Abb. 1c). Diese verringerte Kettenlänge führt möglicherweise zu einer höheren Wahrscheinlichkeit einer Dissoziation, entweder spontan oder als Reaktion auf die Bindung von cGMP an CNB-A. Was auch immer der Mechanismus ist, es deutet darauf hin, dass eine bevorzugte Aktivierung von PKG1α innerhalb eines brauchbaren therapeutischen Fensters möglich ist.

Während die Kristallpackung die Quartärstruktur beeinflussen kann, haben wir die Monomere in den asymmetrischen Kristalleinheiten direkt verglichen, indem wir entweder CNB-B oder CAT unabhängig überlagert haben, um den Einfluss der Umgebungen auf jeden der Kristalle zu beurteilen (Abb. 5a). Dies ergab keine deutlichen Unterschiede innerhalb der einzelnen Einheiten aufgrund der Anwesenheit von Aktivator oder cGMP. Es wurden jedoch Störungen in der Ausrichtung der Schalterhelix relativ zu CAT und CNB-B beobachtet und waren die einzigen nennenswerten Veränderungen, die aufgrund der Ligandenbindung beobachtet wurden (Abb. 4). Das Vorhandensein von ATP veränderte die Ellbogenwinkel zwischen N- und C-terminalen Lappen leicht, was mit anderen Kinasen übereinstimmt. Die Helix dreht sich zwischen 20° und 30° von CNB-B weg, wobei sich die katalytische Domäne am Ende der Helix wie ein starrer Körper verhält (Abb. 4c). Während der Großteil von CNB-B in seiner Konformation relativ konstant bleibt, kommt es zu Beginn des Übergangs der Sequenz von CNB-B zur Helix zu strukturellen Umlagerungen, die direkt zur Rotation, Translation und relativen Ausrichtung der Helix zu CNB-B beitragen . Um das Ausmaß der Bewegung zu verdeutlichen, wurde beobachtet, dass die relative Position des Cα von Tyr336 um etwa 19 Å von seiner ursprünglichen Position abweicht.

Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass sowohl cGMP als auch SMA strukturelle Umlagerungen induzieren, bei denen die Schalterhelix gezwungen wird, sich zu drehen und nach außen zu verschieben, was dazu führt, dass sich die Helix gegen CNB-B und den Liganden und nicht gegen CNB-B allein anlagert. Trotz dieser Ähnlichkeiten unterscheiden sich die Besonderheiten der molekularen Wechselwirkungen deutlich, ebenso wie die Gesamtform des Enzyms bei der Ligandenbindung (Abb. 4d).

Deuteriumaustausch-Massenspektrometrie-Experimente (HDX-MS) mit PKG1α in voller Länge haben gezeigt, dass die cGMP-vermittelte Aktivierung zu einer stärker dem Lösungsmittel ausgesetzten autoinhibitorischen Domäne und Gelenkregion sowie zur Offenlegung von Resten innerhalb der Substratdomäne führt35. HDX-MS-Experimente wurden durchgeführt, um die Art der Aktivierung durch kleine Moleküle wie SMA2 und SMA4 (Abb. 2) aufzuklären, die die Wirksamkeit in Teil- und Grundzuständen von PKG1α zeigen (Abb. 6). Die Änderung der Deuterierung im Vergleich zum inaktiven Zustand zeigt deutlich eine Erhöhung der Zugänglichkeit der ATP-Bindungsdomäne, wenn PKG1α in einer aktivierten Konformation vorliegt. Diese Zugänglichkeit ist im Zustand mit hohem cGMP (Abb. 6a) und bei SMA2 und SMA4 in unterschiedlichem Ausmaß deutlich sichtbar, wobei ein Aktivator Deuterierungsänderungen liefert, die mit dem teilweise aktivierten Zustand vergleichbar sind (Abb. 6d), und der andere mit dem vollständig aktivierten Zustand vergleichbar ist aktivierten Zustand (Abb. 6a). Darüber hinaus stimmten die beobachteten Abnahmen der Deuterierung mit der Bindung von Molekülen an den angegebenen Stellen überein, unabhängig davon, ob cGMP oder Aktivator Abnahmen der Deuterierung hervorriefen. HDX bietet überzeugende Unterstützung für die allosterische Bindung von Aktivatoren an einer Stelle in der Nähe von CNB-B im Volllängenprotein. Interessanterweise bleibt die hochaffine CNB-A-Stelle in Gegenwart von Aktivator unbesetzt und zeigt erhöhte Deuterierungsgrade (Abb. 6b, c), was eine weitere Bestätigung dafür darstellt, dass die beobachtete Aktivierung, die durch die Bindung kleiner Moleküle verursacht wird, auf die Wirkung an einer bestimmten Stelle zurückzuführen ist von dem von cGMP.

Liganden werden in einer Raumfüllung mit cGMP angezeigt, die nach Elementen gefärbt ist, und zwei Aktivatoren, die mit magentafarbenen (SMA2) oder cyanfarbenen (SMA4) Kohlenstoffen gefärbt sind. ATP wird nur als Referenz in Goldstäbchen angegeben. Bänder für Regionen mit verringertem Protonenaustausch sind blau/cyan, während Regionen mit höherem Austausch rot/orange gefärbt sind. Alle Spuren weisen auf die Änderung der Deuterierung in Bezug auf PKG1α allein hin. Liganden wurden überlagert, um die experimentellen Bedingungen anzuzeigen. In allen Szenarien führt die Bindung des Liganden zu einer entsprechenden Abnahme der Deuterierung, wobei an der ATP-Bindungsstelle ein proportionaler Anstieg der Deuterierung beobachtet wird, was auf eine erhöhte Zugänglichkeit der Stelle als Reaktion auf die Aktivierung hinweist. a 1:20 PKG1α zu cGMP, cGMP bindet sowohl an CNB-Domänen mit hoher als auch niedriger Affinität. b, c SMA2 und SMA4 gebunden an die allosterische Aktivierungsstelle. d 2:1 PKG1α zu cGMP, e, f 2:1:5 PKG1α:cGMP:SMA2 in Bezug auf (d) bzw. (e). Während (e) keinen nennenswerten Protonenaustausch als Reaktion auf SMA2 gegenüber dem teilweise aktivierten Zustand (d) zeigt, gibt es einen subtilen, aber spürbaren Anstieg der Deuterierung, der im Vergleich zum Grundzustand (f) beobachtet werden kann.

Basierend auf der Beobachtung, dass sich CNB-B- und CAT-Domänen wie starre Körper verhalten, die durch die Schalterhelix verbunden sind, wurde der Aktivator aus der Struktur entfernt und CAT/SW wurden gedreht und in Richtung der Nestdomäne verschoben. Diese Bewegung brachte Tyr336 in die Region des Nests und brachte die Helix in vollständige Koordination mit dem zuvor besetzten Nest und verschloss teilweise die niedrigaffine zyklische Nukleotidbindungsstelle von CNB-B. Die minimierte Struktur zeigte eine ideale Überlagerung von Tyr336 und Glu340, die die mit SMA1 beobachteten Wechselwirkungen direkt ersetzten und reproduzierten (Abb. 7). Basierend auf molekularmechanischen Kraftfeldberechnungen werden identische H-Aren-Wechselwirkungen zwischen der Phenyleinheit entweder des Aktivators oder der Helix Tyr336 und sowohl Phe222 als auch Phe321 beobachtet. Im Fall von Tyr336 sind diese H-Aren-Wechselwirkungen in der Größenordnung von etwa 0,6 kcal/mol schwächer als im Aktivator. Dies ist wahrscheinlich auf die erhöhte Fähigkeit zurückzuführen, tiefer in den Spalt einzudringen, da das kleine Molekül nicht durch die Bindung an die Helix eingeschränkt wird, was zu leicht verbesserten Stapelwechselwirkungen führt (Abb. 3a und 7a). Wechselwirkungen mit Trp289 bleiben ebenfalls bestehen, allerdings fungiert eine schwache Wechselwirkung zwischen dem Carbonylrückgrat von Glu340 anstelle einer fast 1 kcal starken H-Aren-Wechselwirkung vom Zentralring zum Histidin. Zusätzliche kcal/mol werden bei der Helix-Wechselwirkung beobachtet, die eine Salzbrücke mit Gln296 bildet. Diese starke Wechselwirkung ist wahrscheinlich der Grund dafür, dass viele der Aktivatoren hohe Konzentrationen erforderten, um eine PKG1α-Aktivierung auszulösen25. Die enge Übereinstimmung zwischen Aktivator- und Helix-Wechselwirkungen mit CNB-B stützt stark die Hypothese, dass die PKG1α-Regulation direkt durch die Bindung der Schalterhelix an das Nest vermittelt wird. Darüber hinaus beruht die Aktivität der beschriebenen Aktivatoren, ob S-tides17 oder SMA25, wahrscheinlich direkt auf der Fähigkeit dieser Verbindungen, die Schalterhelix im Nest nachzuahmen und zu verdrängen, wodurch die CAT-Domäne in einen ungeschützten und offenen Zustand versetzt wird.

a SMA1 (Cyan) und cGMP (Magenta) werden als Referenz in den Nest- bzw. zyklischen Nukleotidbindungsstellen dargestellt. Die Oberfläche ist aus Draht gefertigt. b Die Schalterhelix ist zur besseren Visualisierung in grauen Röhren und Linien dargestellt. Wichtige Reste der Schalterhelix markiert und unterstrichen. Beachten Sie die enge Passform von Tyr336 im selben hydrophoben Spalt wie die Dichlorphenylgruppe von SMA1. H-Aren-Wechselwirkungen treten sowohl mit Phe222 als auch mit Phe321 auf. Die Helix scheint durch starke Salzbrücken an Ort und Stelle gehalten zu werden, wobei Wechselwirkungen zwischen Glu340 und Gln296 stattfinden und die Helix durch eine Salzbrücke zwischen Lys342 und T221 aufrechterhalten wird. In beiden Interaktionssätzen wird auch eine zusätzliche Rückgratinteraktion mit W289 beobachtet. c, d Alternative Ansichten der gepackten Helix gegen CNB-B, beachten Sie, dass die cGMP-Bindungsstelle nicht eingeschränkt ist. e In der cGMP/ATP-gebundenen Struktur von 7T4T, mit CNB-B in Cyan und SW in Gold, zeigen Wechselwirkungen mit dem teilweise ungeordneten Schalter, dass Leu328, Ser332 und Tyr336 Trp289 stark chelatisieren, was im Mittelpunkt zu stehen scheint Helix-Wechselwirkungen mit dem Nest in der cGMP-aktivierten Struktur.

Um das Modell zu vervollständigen, wurde eine In-silico-Rekonstruktion aus einer internen Struktur abgeleitet, die die veröffentlichte regulatorische Domäne (PDB: 3SHR) und unsere Struktur der Nukleotidbindungsdomäne/katalytischen Domäne mit niedriger Affinität (PDB: 7T4V) replizierte (Abb. 4). . Die LZ- oder Dimerisierungsdomäne wurde einer zuvor veröffentlichten Struktur (PDB: 4R4L) nachempfunden, wobei die fehlenden autoinhibitorischen Domänen und die Kopplung an Ort und Stelle modelliert wurden. Der teilweise aktivierte 3SHR-Zustand und seine enge Übereinstimmung mit unseren internen Strukturen sowie dem CNB-B unserer CNB-B/SW/CAT-Konstrukte ergaben eine kombinierte regulatorische Domäne und katalytische Struktur, die nur minimale Änderungen am Modell erforderte. Wir haben einen teilweise aktivierten Zustand ausgewählt, da dieser am ehesten mit der Insertion unseres SMA oder cGMP an den CNB-B-Bindungsstellen übereinstimmt. Das resultierende Modell stimmt weitgehend mit berichteten experimentellen Messungen überein und ergibt einen maximal gemessenen interatomaren Abstand von 185 Å und einen Gyrationsradius (Rgyr) von ~62 Å (Abb. 8a). Während der Abstand deutlich innerhalb der berichteten Größenzunahme von 25–30 % gegenüber dem Grundzustand liegt, liegt Rgyr leicht über dem oberen Schwellenwert von 60 Å29. Dieser Wert wurde bei einem cGMP-PKG-Dimer-Molverhältnis von 20:1 bestimmt und basiert auf der Sättigung durch cGMP. Wie zu beobachten ist (Abb. 4d), führt die Besetzung des CNB-B-Nests zu einer Vergrößerung des Helixwinkels um ~20° und einer weiteren Ausdehnung des CAT vom zentralen Kern des Dimers weg. Ein Anstieg von Rgyr um ~2 Å würde diesen Beobachtungen entsprechen.

Rekonstruiertes PKGIα-Homodimer basierend auf Kristallstrukturen aller Domänen. Die Domänen sind gemäß dem Schema in Abb. 1 gefärbt. LZ (Magenta), AI (Lila), CNB-A (Blau), CNB-B (Cyan), SW (Gold), CAT (Rot). Domänenüberlagerungen zeigen eine Gesamtatom-RMSD in der Größenordnung von <1,0 Å. Die Modelle basierten auf Leucine Zipper (LZ) (PDB: 4R4L), Regulatory Domain (PDB: 3SHR), CNB-B/SW/CAT (PDB: 7T4V). Im aktivierten Zustand (a) wurde die Verbindung zwischen LZ und der regulatorischen Domäne modelliert und ist die einzige Domäne ohne kristallographische Grundlage. Die zyklischen Nukleotidbindungsstellen, beginnend mit der hochaffinen (CNB-A) und der niedrigaffinen (CNB-B), werden nacheinander durch Bindung von cGMP aktiviert, um schließlich die Aktivierung der katalytischen Domäne durch Bewegung und Freilegung des katalytischen Domain. SMAs binden neben der cGMP-Bindungsstelle von CNB-B mit niedriger Affinität. b Bemerkenswert im autoinhibierten Apo-Zustand ist die Kompaktheit der Struktur: Die CAT-Domäne sitzt auf der regulatorischen Domäne (CNB-A/CNB-B) der gepaarten Kette, wird jedoch durch die AI ihrer eigenen Kette gehemmt. In (c) wird das System um 45° zum Betrachter gedreht, um die Selbsthemmung sichtbar zu machen. Die erste Kette ist in Bändern dargestellt, während die zweite Kette eine nach Domänen gefärbte Moleküloberfläche aufweist. Aus dieser Perspektive ist die Einzelkettenorganisation besser erkennbar. Liganden wurden als Referenz in ihre Bindungstaschen gerendert und als Raumfüllung platziert. Beachten Sie die Positionierung der SMA in der Nestregion der CNB-B-cGMP-Bindungsstelle. In diesem Zustand überlappt die SMA mit dem N-Terminus der SW-Helix. Sowohl die CNB-B- als auch die CNB-A-Bindungsstellen sind in diesem Zustand lösungsmittelzugänglich. d Vergrößert im Hinblick auf die an die katalytische Stelle gebundene AI-Domäne. Beachten Sie, dass die mutmaßliche Phosphorylierungsstelle des Substrats derzeit von G63 des Pseudosubstrats besetzt ist, was zum derzeit automatisch inhibierten Zustand führt.

Die kürzlich veröffentlichte autoinhibierte Struktur von PKG1β (PDB: 7LV3) zeigt eine trans-Autoinhibition durch Bindung des Pseudosubstrats an die CAT-Domäne19. Einzelne Domänen in diesem autoinhibierten Zustand sind in ihrer Struktur äußerst ähnlich und weisen einen RMSD von unter 1 Å auf. Trotz der kristallographischen Transhemmung gibt es Hinweise darauf, dass die cis-Hemmung die vorherrschende Form der Regulation ist19. Um dies strukturell weiter zu untersuchen, haben wir das Monomer mit AlphaFold36 generiert. Das erzeugte Monomer (ergänzende Abbildung 4a) wurde der CAT-Domäne von 7LV3 überlagert. Bei der anfänglichen Überlagerung gelang es nicht, die Strukturen richtig auszurichten, was wahrscheinlich auf die Zuordnung der CAT-Domäne zu CNB-A/B in der getrennten Dichte zurückzuführen ist. Laut den Autoren von 7LV319 ist es möglich, die fehlende Dichte als zusammenhängend mit den nebeneinander liegenden Domänen zu interpretieren. Dabei stimmte die Überlagerung aufgrund der Alpha-Helix-Verbindungen zwischen den Domänen weitgehend mit geringfügigen Positionsabweichungen überein (ergänzende Abbildung 4b). Allerdings ist für die einzelnen Domänen ein hoher Grad an Übereinstimmung zu beobachten. Darüber hinaus wird das Pseudosubstrat innerhalb der katalytischen Stelle gebunden, während der Rest der LZ willkürlich in die Lösung ausgedehnt wird. Da monomeres PKG1 eine Selbstregulierung zeigt, ist es wahrscheinlich, dass dies eine vernünftige Konformation für das vollständig autoinhibierte PKG1α-Monomer ist (ergänzende Abbildung 4a).

Anschließend nutzten wir AlphaFold-Multimer37, um zu untersuchen, ob es in ähnlicher Weise eine cis-Inhibition vorhersagen oder die veröffentlichte trans-inhibierte Struktur rekapitulieren würde. Es überrascht nicht, dass die von AlphaFold erzeugte Struktur eine Transhemmung annahm, jedoch keine Rückschlüsse auf die dimere Natur der LZ-Helices ziehen konnte (ergänzende Abbildung 4c). Die Struktur wurde wahrscheinlich durch die Existenz von 7LV3 in seinen Trainingsdaten beeinflusst. Trotz der Probleme wurde dies zum Ausgangspunkt für die Konstruktion des Apo-Autoinhibitionsmodells.

Wie bei der Rekonstruktion für das aktivierte PKG1α verwendeten wir eine LZ-Vorlage (PDB: 4R4L), um ein vollständiges Modell zu erstellen. LZ ersetzte die modellierten Reißverschlusshelices und wurde entlang der Mittelachse platziert, um den Abstand von jedem Mitglied des Dimers sowohl im trans- als auch im cis-AlphaFold-Modell zu minimieren. Das System wurde in MOE minimiert, indem jeder Lappen als starrer Körper behandelt wurde. Dies bedeutete, dass für das Trans-Modell ein Lappen aus CNB-A, CNB-B einer Kette und dem CAT der gegenüberliegenden Kette bestand. Beim cis-Modell hingegen wurden CNB-A, CNB-B und CAT von derselben Kette abgeleitet. Die Schalterhelix sowie die autohemmende Region zwischen LZ und PS konnten sich frei entspannen. Auch der LZ wurde als Starrkörper behandelt.

Während sowohl die cis- als auch die trans-Dimere rechnerisch zugänglich sind, stimmt die „trans“-Dimerhelix mit den hier beschriebenen Strukturen überein (PDB: 7T4T, 7T4U, 7T4V und 7T4W), wobei die CNB-B- und CAT-Domänen durch die SW-α- Wendel. Diese Konformation hat das zusätzliche Merkmal, dass die CNB-B-SMA-Bindungsstelle im inhibierten Zustand durch die SW-Helix verschlossen bleibt. Basierend auf Sharma et al.19 scheinen PKG1β und wahrscheinlich auch PKG1α in cis autoinhibiert zu sein. Bei der Rekonstruktion des Modells erleichtert die Position von LZ und AI einen „Domänenwechsel“ der AI von der gegenüberliegenden Kette. Auf diese Weise wird die cis-Hemmung korrekt eingekapselt. Dies führte zum endgültigen Modell (Abb. 8b), bei dem CNB-A und CNB-B CAT der Gegenkette flankieren. Die cis-AI-Region ist so positioniert, dass sie die Autohemmung erleichtert (Abb. 8c, d). Darüber hinaus stimmen die Positionen von CNB-B, SW und CAT mit den bisher veröffentlichten Kristallstrukturen überein.

Der Aufbau des vollständigen Dimers sowohl in einem kompakten apo-autoinhibierten Zustand als auch in einem vollständig ausgedehnten aktivierten Zustand hat unser Verständnis der Mechanismen der Regulierung, Aktivierung, Reorganisation und Katalyse vereinfacht (Abb. 9). In Abwesenheit von cGMP liegt ein kompakter autoinhibierter Zustand vor, in dem die AI-Sequenz an die katalytische Domäne eines Monomers bindet. Dies gilt sowohl im Monomer- als auch im Dimerzustand. Es ist die automatische Dissoziation der PS- und AI-Domänen, die zu einer basalen Kinaseaktivität führt, die in Abwesenheit von cGMP vorhanden sein kann. Wasserstoff/Deuterium-Austauschexperimente haben gezeigt, dass die AI-Domäne in PKG1β in Abwesenheit von cGMP38 mit der Zeit zunehmend deuteriert wird, was mit einer vorübergehenden Freisetzung und Reassoziation vereinbar ist. Es gibt keine Hinweise darauf, dass bei der α-Isoform kein ähnlicher Mechanismus im Spiel ist.

a Auto-inhibiertes Apo-PKG1α, gesehen entlang der Achse der LZ-Helices (Magenta), die zu den AI-Sequenzen (lila) führen. Diese schleifen um die CAT-Domäne derselben Kette und hemmen sie automatisch. b In der gerenderten Zeichnung des vorgeschlagenen mechanistischen Pfades ist die Domänenorganisation des Dimers viel deutlicher zu erkennen, wobei die LZ dazu dient, die Dimere an Ort und Stelle zu fixieren und gleichzeitig die AI-Domänen der cis-Kette jeder CAT-Domäne angemessen zu präsentieren. Während die Grundaktivität durch eine vorübergehende Trennung der AI von der CAT-Domäne (nicht abgebildet) vermittelt werden könnte, dient der Apo-Autoinhibitionszustand als Ausgangspunkt für die Aktivität. Dies geht in den teilweise aktivierten Zustand über, in dem durch die Bindung von einem oder zwei cGMP (Goldhexagon) an CNB-A-Domänen die Dissoziation der AI-Domäne von CAT ausgelöst wird, wodurch das System die Ausdehnung von der Mittelachse des Dimers weg initiieren kann. Durch diese Aktion wird CNB-A jeder Kette in unmittelbare Nähe gebracht, wodurch CNB-B und die CAT-Domäne weiter vom Kern entfernt werden. Die anschließende Bindung von cGMP an CNB-B verschiebt die SW-Helix, wodurch CAT weiter verschoben und in einen vollständig offenen und zugänglichen Zustand gebracht wird. Ein nahezu identischer Prozess findet in Gegenwart des SMA (schwarzes Quadrat) statt, mit der Ausnahme, dass das zweite cGMP durch die SMA-Bindung an die Nestdomäne ersetzt werden kann, was ebenfalls eine vollständige Aktivierung hervorruft.

Wir gehen davon aus, dass der dramatische Anstieg der SMA-Aktivität im teilweise aktivierten Zustand wahrscheinlich auf diese Autohemmung zurückzuführen ist. Wenn die AI-Domäne gebunden ist, verhindert die kompakte Struktur eine Bewegung von CAT vom zentralen Kern von PKG1 weg. Wie im In-silico-Apo-Modell zu sehen ist, kreuzt die Schalterhelix direkt die als Referenz dienende SMA (Abb. 8c). Dies würde dazu führen, dass der SW an der Neststelle gebunden bleibt und die Bindung des SMA verhindert wird (Abb. 7b – d). Während der automatischen Dissoziation oder teilweisen Aktivierung hält der AI-Tether CAT nicht mehr an Ort und Stelle, sodass der Nistplatz an CNB-B geöffnet werden kann (Abb. 4c, d).

Abgesehen von der Grundaktivität ist der regulierte Weg cGMP-abhängig und würde normalerweise ein cGMP erfordern, um aktiviert zu werden. Die vorgeschlagene Struktur stimmt mit der kürzlich für PKG1β19 beschriebenen überein und weist sowohl CNB-A- als auch CNB-B-cGMP-Stellen auf, die dem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Theoretisch könnte jede Stelle zuerst cGMP binden, aber die Bindung an CNB-B wird wahrscheinlich keine Aktivierung hervorrufen, insbesondere wenn die AI-Domänen beteiligt sind. Es bindet an CNB-A, was die Dissoziation von AI von CAT auslöst, wodurch eine Drehung jedes cGMP-gebundenen Monomers gegen den Uhrzeigersinn um etwa 30° in der Ebene beginnt. Dadurch bilden CNB-A und CNB-A' den Kern der in 4Z0720 beobachteten Rautenform. In diesem teilweise ausgedehnten Zustand ist PKG1 katalytisch aktiv, allerdings mit verringerter Geschwindigkeit (ergänzende Abbildung 1). Bei der Bindung des zweiten cGMP erstreckt sich die Schalterhelix aus der CNB-B-Nestregion heraus, destabilisiert die Schalterhelix und (Abb. 4b) und fördert alternative Wechselwirkungen in der Nähe des CNB-B-Nests (Abb. 7e), wodurch die Struktur weiter ausgedehnt wird vom Kern von PKG1 entfernt. Im Gegensatz dazu führt die Bindung der SMA innerhalb des Nests zu einer Stabilisierung der Helix, wie beim Vergleich der überlagerten SW in Abb. 4d beobachtet werden kann. Diese Stabilisierung ist auf die beobachteten direkten Wechselwirkungen zwischen SMA und SW zurückzuführen (Abb. 5b). Das CNB-B-Nest wird vom SW abgedeckt, was die Eigenschaften des SMA ergänzt, indem es die hydrophobe Tasche verstärkt und wechselwirkende Reste für die dem Lösungsmittel ausgesetzten Regionen bereitstellt (Abb. 5b). Bei dieser maximalen Ausdehnung ist die katalytische Bindungsstelle vollständig freigelegt, mit begrenzter Zugänglichkeit und eingeschränkter Möglichkeit zum Eingreifen oder Binden des AI, sofern cGMP oder SMA gebunden sind.

Die Strukturen von CNB-B, der Schalterhelix und der katalytischen Untereinheit bieten zusammen einen atomaren Überblick darüber, wie diese Domänen in einem aktivierten Zustand interagieren. Die klare Visualisierung der Bindungsregion für die SMAs liefert genaue Informationen über die Wechselwirkungen und Mechanismen beim Übergang von einem geschlossenen/inaktiven Zustand in einen offenen und aktiven Zustand. Diese Aktivierung ist größer als die Aktivierung, die durch submaximale cGMP-Konzentrationen allein erreicht wird. Noch wichtiger ist jedoch, dass die Kombination der CNB-Domänen mit der katalytischen Domäne auf eine neuartige Struktur im aktivierten Zustand hindeutet, die bisher für PKG1α noch nicht beschrieben wurde. Zusätzliche Modellierung und Integration dieser Strukturen mit dem kürzlich veröffentlichten autoinhibierten PKG1β-Monomer haben die notwendigen Erkenntnisse geliefert, um ein brauchbares Modell des autoinhibierten PKG1α-Dimers vorzuschlagen, das mit unserem bisherigen experimentellen Wissen über diese Proteinkinase übereinstimmt. Das vorgeschlagene Aktivierungsmodell wäre sowohl auf PKG1α als auch auf PKG1β anwendbar. Alle veröffentlichten Strukturen beider Isoformen stammen aus dem monomeren Protein, obwohl natürlich auch Dimere für die aktivierte regulatorische Domäne gefunden wurden. Wir freuen uns auf die zukünftige strukturelle Validierung unserer vorgeschlagenen Modelle des Proteindimers, um unser Verständnis des PKG1α/β-Systems zu vervollständigen.

Alle Sequenz-IDs beziehen sich auf UniProtKB für die cGMP-abhängige Proteinkinase 1-Isoform Alpha, ID:Q13976-1 (KGP1_HUMAN)39.

Strukturen wurden mit dem Kraftfeld AMBER14:EHT40,41 vorbereitet und minimiert.

Die Moleküle wurden mit der Docking-Anwendung in MOE 2019.010242 unter Verwendung des Dreieck-Matcher-Platzierungsalgorithmus angedockt, wobei bis zu 100 Posen für die Platzierung und 50 Posen für eine endgültige Verfeinerung beibehalten wurden.

Homologiemodelle wurden ursprünglich mit 3SHR als Vorlage mithilfe der Homology Modeler-Anwendung in MOE 2019.010242 erstellt. Diese Modelle wurden durch Rekonstruktion, Überlagerung und Optimierung mit Co-Kristallstrukturen in MOE 2019.0102 weiter verfeinert und verbessert. Die Dimerisierungsdomäne wurde manuell modelliert und mit dem Leucin-Zipper und der regulatorischen Domäne verknüpft.

AlphaFold v2.2.4 wurde eingesetzt und verwendet, um sowohl eine Monomer- als auch eine Dimerstruktur zu erzeugen36,37.

SMAs wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Kinaseaktivität von PKG1α (menschliches PKG1α2–671) in voller Länge (aus dem basalen und teilweise aktivierten Zustand) zu aktivieren, und zwar genau nach dem zuvor veröffentlichten Verfahren23,24,25. Kurz gesagt wurde eine auf Lumineszenz basierende Nachweismethode (ADP-Glo, Promega) verwendet, um die Kinaseaktivität zu verfolgen. Enzym- und Substratarbeitslösungen wurden unter Verwendung der folgenden Testpufferbedingungen hergestellt: 50 mM Hepes, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 5 mM β-Mercaptoethanol (BME), 0,01 % Triton X-100, pH 7,3 (BSA, BME und Triton X-100 wurden am Tag des Experiments frisch zur Stammpufferlösung gegeben). Testverbindungen in DMSO-Lösung wurden akustisch zugegeben (200 nl) zu einer weißen Mikroplatte mit 384 Vertiefungen, gefolgt von der Zugabe einer 8-μl-Mischung aus PKG1α und dem Peptidsubstrat Glasstide (Anaspec) in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 nM cGMP. Die Mischung aus Verbindung und Enzym wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) vorinkubiert, bevor 2 μl ATP hinzugefügt wurden, um die Reaktion zu starten (endgültige Testbedingungen: 5 nM PKG1α, 150 μM Glasstid, 1 mM ATP, 0 oder 10 nM cGMP). , Testverbindung). Nach 2-stündiger Inkubation bei RT wurde die in ADP umgewandelte ATP-Menge anhand der Anweisungen des ADP-GLO Max Assay-Kits bestimmt. Das Lumineszenzsignal wurde mit einem Plattenlesegerät von Envision (PerkinElmer) abgelesen. Die prozentuale PKG-Aktivierung wurde relativ zum vollständig aktivierten PKG1α unter Verwendung von cGMP (100 % Aktivierungskontrolle) berechnet. Der EC50-Wert wurde mithilfe einer Vier-Parameter-Anpassungsanalyse einer halblogarithmischen Auftragung des %-Effekts gegenüber der Verbindungskonzentration bestimmt.

Die Methode der mikroskaligen Thermophorese (MST) wurde verwendet, um die Bindungsaffinitäten (Kd) von SMAs für PKG1α in voller Länge (menschliches PKG1α2–671) oder Fragment der regulatorischen Domäne (Rinder-PKG1α79–356) abzuschätzen. PKG1α wurde mit NT-647-NHS unter Verwendung des MonolithNT Protein Labeling Kit RED-NHS (NanoTemper, L001) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Kurz gesagt, PKG1α wurde ausgetauscht und in Markierungspuffer verdünnt, der mit 0,01 % Triton Ein gleiches Volumen von 43,5 μM NT-647-NHS im gleichen Puffer wurde zu PKG1α gegeben und die resultierende Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. NT-647-markiertes PKG1α wurde durch Gelfiltration in Testpuffer (50 mM Hepes, pH 7,3, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,01 % BSA, 0,01 % Triton X-100 und 2 mM TCEP) gereinigt. . Das Endprodukt hatte eine Konzentration von 3,1 μM oder 4,8 μM und wurde mit einer Stöchiometrie von 1:1,2 oder 1:0,94 von PKG1α:NT-647 für menschliches PKG1α2–671 (in voller Länge) bzw. Rinder-PKG1α79–356 markiert. Zur Messung der Affinität der Verbindung zum Zielprotein wurden 200 nl seriell verdünnte Verbindung in DMSO auf 10 μl 10 nM Protein mit unterschiedlichen cGMP-Konzentrationen im Testpuffer verteilt. Nach einer 30-minütigen Äquilibrierungsperiode wurden die Proben in hydrophile Monolith NT.115-Kapillaren (NanoTemper, K004) geladen und auf einem Monolith NT.115-Gerät mit einer MST-Leistung von 35 % oder 60 % für menschliches PKG1α2–671 oder Rinder-PKG1α79 abgelesen –356 und einer LED-Leistung von 90 %. Die nach 5 s Thermophorese gemessene Änderung der normalisierten Fluoreszenz wurde in GraphPad Prism an eine Dosis-Wirkungs-Gleichung mit vier Parametern angepasst, um die Kd-Werte zu bestimmen23.

Die modulierende Wirkung von SMAs auf die cGMP-Affinität für PKG1α voller Länge (humanes PKG1α2–671) wurde mithilfe der Fluoreszenzpolarisationsmethode gemäß veröffentlichter Verfahren23 verfolgt. Zwei Tests ermöglichten die Verfolgung von Veränderungen der cGMP-Affinität für CNB-A oder CNB-B in Gegenwart von SMA.

Um die allosterischen Wirkungen von SMAs auf CNB-A zu bestimmen, wurde kurz gesagt eine feste Konzentration der FP-Sonde (8-Fluo-cGMP) verwendet. FP-Messungen wurden in 50 mM HEPES, pH 7,3, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,01 % BSA, 0,01 % Triton X-100 und 2 mM TCEP in 384-Well-Platten (Corning 4514) unter Verwendung von a durchgeführt Endvolumen von 10 µl. Die Affinität (Kd) der FP-Sonde für CNB-A von PKG1α wurde durch Mischen von 5 μl einer Reihenverdünnung von PKG1α mit 2-facher Konzentration mit einem gleichen Volumen einer 2-fach festgelegten Konzentration der Sonde bestimmt. Die Endkonzentration der Sonde betrug 0,5 nM, wodurch sichergestellt wurde, dass nur die CNB-A-Bindung gemessen wurde. Bindungsreaktionen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und der Polarisationszustand der Sonde wurde auf einem PheraStar Plus-Plattenlesegerät (BMG) gemessen. Die Affinität der FP-Sonde wurde durch Anpassen der PKG1α-Konzentrationsreaktionsdaten in GraphPad Prism mithilfe einer quadratischen Gleichung bestimmt, die die Ligandenverarmung berücksichtigt. Um die Wirkung von SMA auf den beobachteten Kd zu bestimmen, wurde die serielle PKG1α-Verdünnung in Gegenwart verschiedener SMA-Konzentrationen wiederholt, indem 200 nl SMA akustisch zu den PKG1α/Sonden-Mischungen verteilt wurden, bevor eine Stunde lang äquilibriert wurde.

Um allosterische Effekte von SMAs auf CNB-B abzuleiten, wurde ein Titrationsschema mit festem Verhältnis (von PKG1:Sonde) verwendet. Experimentell waren die Bedingungen und das Verfahren die gleichen wie oben für die Bestimmung der Affinitäten bei CNB-A beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen. 10 μl einer Reihenverdünnung von PKG1α:Sonde (1:2) mit festem Verhältnis wurden zur Testplatte gegeben, gefolgt von einer akustischen Abgabe von 200 nl SMA-Verbindung in DMSO. Jeder PKG1α:Sondenkonzentrationszustand wurde unabhängig abgelesen und auf eine Vertiefung mit einer passenden Sondenkonzentration ohne PKG1α normalisiert. Um aus diesen Daten die Sondenaffinität für die CNB-B-Stelle zu bestimmen, wurden die Konzentrations-Reaktionskurven mithilfe eines Satzes zuvor beschriebener Gleichungen in GraphPad Prism angepasst23.

Die Reste T204 bis F671 wurden mit einem N-terminalen Octahistidin-Tag gefolgt von einer TEV-Spaltungsstelle (MAHHHHHHHHENLYFQS-204TGL.IDF671) in pTRIEx4 kloniert. Protein wurde in Sf21-Insektenzellen exprimiert. Die Zellen wurden in 20 l Sf900II-Medium (enthaltend 5 μg ml-1 Gentamicin) in einem 50-l-Wellenbeutel mit 0,65 × 106 Zellen ml-1 ausgesät und man ließ sie über Nacht in ihrer Dichte verdoppeln. Die Dichte der Übernachtkulturen wurde bestimmt und die Zellen anschließend mit P2 BIICS bei einer Infektionsmultiplizität von 0,2 infiziert. Die infizierten Kulturen wurden ca. 72 Stunden lang bei 27 °C inkubiert. Die Kultur wurde durch Zentrifugation bei 3400 × g, 15 min, 4 °C geerntet und die Pellets bei –80 °C gelagert.

Die Zellen wurden in 25 mM Tris/HCl, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 20 mM Imidazol, pH 7,0, mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Complete) und hinzugefügter Benzonase gemäß den Empfehlungen des Herstellers lysiert. Das Protein wurde einer IMAC unter Verwendung einer 5-ml-HisTrap-Roh-FF-Säule und einer Flussrate von 4 ml/min unterzogen. Nach einem 50-ml-Waschvorgang mit 20 mM Imidazol wurde das hochgereinigte Protein in einem Gradienten von 20 bis 500 mM Imidazol über 20 CV eluiert. Das gepoolte Protein wurde über Nacht mit TEV-Protease (Massenverhältnis 1:30) behandelt und dann durch subtraktive IMAC weiter gereinigt, die im Wesentlichen wie im ersten Schritt durchgeführt wurde. Ein abschließender Gelfiltrationsschritt wurde unter Verwendung einer S200 26/60 pg-Säule durchgeführt, die in 20 mM Tris/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP äquilibriert war. Das Protein wurde unter Verwendung von Zentrifugalfiltern aus regenerierter Zellulose mit einem MWCO von 10 kDa auf eine Konzentration von 10 mg ml-1 konzentriert.

Zur Kristallisation wurde das Protein über Nacht mit 1 mM (ATP, cGMP: 10 mM) der Verbindung (2 % DMSO außer Nukleotidkomplexen) inkubiert. Unter Verwendung der anfänglichen Kristalle für die Mikroimpfung konnten Kristalle leicht aus mehreren Positionen des PACT-Bildschirms (molekulare Abmessungen, z. B. Vertiefungen A05, A03, B06, G08) erhalten werden. Kristalle wuchsen innerhalb weniger Tage nach dem Mischen von 100 nl Protein mit 80 nl Reservoir und 20 nl Keimlösung. Die Kristalle wurden durch direkte Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff ohne weitere Kryokonservierungsbehandlung oder nach Überführung in 20 % Ethylenglykol im Reservoir geerntet.

Beugungsdaten wurden am Diamond-Synchrotron gesammelt und in CCP4 mit AIMLESS43 verarbeitet. Mit PHASER44 wurde eine molekulare Ersatzlösung gefunden, die Kette B der zuvor beschriebenen Struktur 4KU845 und die Kinasedomäne von PKG 1a (PDB: 6C0T)26 nutzt. Anschließend wurde die Struktur mit COOT46 und autoBUSTER47 aufgebaut und verfeinert.

Biochemische und biophysikalische Experimente wurden in mehreren unabhängigen Versuchen durchgeführt, wie in den Abbildungslegenden angegeben (Abb. 2 und ergänzende Abbildungen 1 und 3). Fehlerschätzungen wurden als Standardfehler des Mittelwerts (±SE) ausgedrückt. Die Fehlerbalken in der ergänzenden Abbildung 2 stellen SE der nichtlinearen Regressionsdatenanpassung der kleinsten Quadrate dar. Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Rohdaten, die den Diagrammen in Abb. 2 zugrunde liegen, und ergänzende Informationen finden Sie in der mitgelieferten Excel-Datei mit ergänzenden Daten. Röntgenkristallstrukturen sind unter https://www.rcsb.org über die folgenden Aufstiegscodes verfügbar: 7T4V, 7T4U, 7T4T, 7T4W und 7SSB. Das Monomermodell von AlphaFold ist unter Q13976 https://www.alphafold.ebi.ac.uk verfügbar. Dimere Modelle sind auf Anfrage erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Michael Hayes und Dr. Kanaka Hettiarachchi für die Unterstützung bei der Hochdurchsatzreinigung, Aimie Ogawa für die Unterstützung beim Kinase-Assay, Jennifer Hadix für die Logistik des Verbindungsmanagements und Melissa Lin für die analytische Unterstützung.

Modellierung und Informatik, MRL, Merck & Co., Inc., 213 E. Grand Avenue, South San Francisco, CA, USA

Essam Metwally und Alan C. Cheng

Discovery Chemistry, MRL, Merck & Co., Inc., 213 E. Grand Avenue, South San Francisco, CA, USA

Victor Mak, Rose Yen, Akash Patel, Yeon-Hee Lim und Tom Greshock

Quantitative Biosciences, MRL, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA

Aileen Soriano und Paul Tawa

Evotec (UK) Ltd, 114 Innovation Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RZ, Großbritannien

Matthias Zebisch, H. Leonardo Sylvester, Paul A. McEwan und John J. Barker

Discovery Bioanalytics, MRL, Merck & Co., Inc., 213 E. Grand Avenue, South San Francisco, CA, USA

Grigori Ermakov und Maribel Beaumont

Discovery Biology, MRL, Merck & Co., Inc., Boston, MA, USA

David Healy

Discovery Chemistry, MRL, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA

Jennifer Hanisak

Protein- und Strukturchemie, MRL, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA

Thierry O. Fischmann

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Modellierung: EM und ACC; Chemie: VM, Y.-HL, RY, AP, JH und TG; Kristallographie: MZ, HLS, PAM, JJB und TOF; HDX: GE und MB; Konzept: EM, TOF und TG; Methoden: EM, AS, GE, MB und TOF; Datenkuration: EM, VM und AS; Untersuchung: EM, AS und VM; Datenanalyse: EM, TG, GE und MB; Biologische Tests: PT und DH; Schreiben: EM, AS und TOF; Rezension: EM, AS, TG, TOF, VM, Y.-HL und ACC

Korrespondenz mit Essam Metwally oder Thierry O. Fischmann.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: Während der Durchführung dieser Arbeit waren alle Autoren Mitarbeiter von Tochtergesellschaften von Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA und Aktionäre von Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA mit Ausnahme von MZ, HLS, PAM und JJB, die bei Evotec (UK) Ltd. beschäftigt waren.

Communications Biology dankt Patrick Eyers und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Isabelle Lucet und Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Metwally, E., Mak, V., Soriano, A. et al. Strukturelle Einblicke in die selektive Aktivierung von PKG1α durch kleine Moleküle. Commun Biol 6, 798 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05095-4

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Eingegangen: 28. März 2022

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05095-4

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